赛默飞2720PCR仪反应过程与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。

 

　　样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为zui大，这样可以获得准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。

 

　　在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。

 

　　赛默飞2720PCR仪扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散是怎么回事？

 

　　1、降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

 

　　2、酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

 

　　3、若为PCR试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

 

　　4、退火温度过低。

 

　　5、引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

 

　　6、循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

 

　　7、MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

 

　　8、模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

 

　　9、电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。

 

　　10、dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。